La conta delle cellule di lievito S. Cerevisiae prima del tiraggio è fondamentale per assicurare il corretto svolgimento della presa di spuma in bottiglia o in autoclave.
Dopo aver prodotto il pied de cuve utilizzando l’apposito protocollo, è opportuno verificare la popolazione attiva di lievito, contando le cellule vive, quelle morte e la percentuale di gemmazione. Questo è il primo step per assicurarsi che la presa di spuma abbia un andamento regolare e consenta il totale consumo dello zucchero aggiunto al vino base, tuttavia raccomandiamo di seguire tutte le indicazioni che puoi trovare qui per un corretto svolgimento di tale operazione.
1 Campo d’applicazione
Questo metodo consente di valutare rapidamente la percentuale di cellule vitali di lievito S. Cerevisiae, necessario determinare i cambiamenti nella popolazione microbica durante la preparazione delle colture starter; è applicabile a tutti i campioni contenenti lieviti, tranne i mosti con più di 100 g/l di zucchero. Le tecniche di conteggio microscopiche sono le più rapide ma richiedono almeno 104 cellule per ml, valori normalmente presenti negli starter preparati per la presa di spuma.
I batteri sono troppo piccoli, perciò la loro presenza non è rilevabile con questo metodo.
Nota: è importante la focalizzazione con l’ottica del microscopio delle cellule a varie profondità, per visualizzarne correttamente la colorazione con il blu di metilene.
2 Principio
Il blu di metilene è trasformato nel suo derivato incolore dall’attività riduttrice delle cellule di lievito vitali. Le cellule di lievito morte assumeranno la colorazione blu.
La vitalità si calcola sulla base del rapporto tra cellule vitali e le cellule totali. Questo metodo sovrastima la vitalità “reale” se le cellule vitali sono meno dell’80%, poiché esso non fa distinzione tra le cellule “vive” e la loro capacità di riprodursi (cellule vitali ma non adatte a coltura).
Se la concentrazione di zucchero supera i 100 g/l, quasi tutte le cellule sono celesti, rendendo inutilizzabile questo metodo.
Il colorante non può funzionare correttamente con i vini a basso pH e fortemente tamponati. In questi casi il conteggio va eseguito almeno sulla prima diluizione decimale.
3 Impianti e attrezzature
Microscopio, 40-500 x ingrandimenti. Contrasto di fase controindicato.
Vetrini e vetrini di protezione scorrevoli per microscopio o emocitometro (camera di Thoma, Bürker o Neubauer).
Vortex o altro sistema di agitazione.
Provette da test e asta agitatrice.
Pipette, puntali sottili.
Soluzione fisiologica.
5 Tecniche di esame
Determinazione della vitalità
Per stimare la popolazione di microrganismi vitali, è importante ottenere un campione omogeneo, quindi i lieviti nella coltura starter devono essere agitati per miscelare uniformemente il contenuto appena prima del campionamento, utilizzando un Vortex o altro sistema.
Diluire il lievito in sospensione con la soluzione di blu di metilene in una provetta da test, fino a che la sospensione non abbia circa 100 cellule di lievito in un campo microscopico. Si opera normalmente con una serie di diluizioni, la diluizione minima è 10 volte (1 mL + 9 mL, 1:10). In pratica, le diluizioni vengono eseguite trasferendo 1 ml di campione in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica, procedendo fino alla diluizione ricercata.
L’esecuzione di diverse diluizioni più piccole anziché di un numero inferiore di diluizioni più grandi (ad esempio, quattro diluizioni 1:10 sequenziali contro due diluizioni sequenziali 1: 100) riduce l’errore sperimentale.
Deporre una piccola goccia di sospensione ben mescolata su un vetrino da microscopio e coprire con un vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non incorporare aria, le cui bolle potrebbero essere fonte di errore nella conta.
Esaminare al microscopio con un ingrandimento di 100x (o similare) entro 10 minuti dal contatto con il colorante.
Contare un totale di 400 cellule, annotando il numero di cellule morte, rotte, avvizzite e plasmolizzate colorate di blu. Le cellule di lievito in fase di gemmazione si contano come una cellula unica se le dimensioni della gemma sono inferiori alla metà della cellula madre. Se le dimensioni della gemma sono uguali o maggiori di metà di quelle della cellula madre, si contano entrambe le cellule.
Le cellule colorate di azzurro chiaro vanno considerate vive.
Se T è il numero totale delle cellule e C il numero delle cellule colorate di blu; la percentuale delle cellule vitali è allora x100
Cellule vitali: T = C/T x 100
Valutare in funzione di tale percentuale se procedere con il tiraggio.
La determinazione delle cellule vive/morte può essere fatta direttamente con l’emocitometro (es. vetrino Burker).
Conta delle cellule
La camera di Burker è un particolare emocitometro utilizzato per determinare il numero di cellule per unità di volume di un liquido e le cellule sono visivamente contate per mezzo di un microscopio ottico; è costituita da: una base di vetro dove è presente un rialzo che contiene una minutissima griglia, più precisamente abbiamo una griglia nel riquadro superiore ed una nel riquadro inferiore e da due pinzette disposte lateralmente.
La camera ha un reticolo composto da diversi quadrati, il conteggio deve essere fatto in un quadrato di 1 mm di lato (delimitato da tre linee per lato). Poiché il vetro di copertura si trova esattamente a 0,1 mm sopra il fondo della camera, il volume del liquido sotto ciascuno dei quadrati grandi è di 0,1 mm3 o 0,1 μL.
Gli emocitometri hanno due pozzetti a camera, ciascuno contenente un volume specifico di liquido. I pozzetti vengono riempiti la sospensione cellulare posizionando una pipetta nella scanalatura a forma di V e consentendo all’azione capillare di attirare il liquido nella camera. Dopo aver consentito alle cellule di stabilizzarsi, viene avviato il conteggio.
Per ottenere i migliori risultati, il numero di celle dovrebbe essere compreso tra 20 e 100 cellule per quadrato grande, numeri più elevati rendono la conta delle cellule difficoltosa. Conoscendo le diluizioni utilizzate nella sospensione originale e il volume di liquido esaminato al microscopio, è possibile stimare la popolazione originale (cellule/mL).
Per migliorare l’accuratezza, entrambe le camere su un emocitomero dovrebbero essere contate e un numero sufficiente di quadrati dovrebbe essere contato per dare un conteggio totale di circa 600 cellule. Soprattutto, è necessario che ogni laboratorio stabilisca se le cellule che si trovano sui confini o sulle linee della griglia devono essere incluse nel conteggio o rifiutate. A seconda delle diluizioni iniziali, l’incongruenza a questo riguardo può avere un grande effetto sulla stima della popolazione effettiva di microrganismi.
Una procedura sarebbe contare quelle celle che si sovrappongono a una linea della griglia nella parte superiore o destra di un quadrato (in giallo) ma non contare quelle celle che si sovrappongono alle linee della griglia sulle linee sinistra o inferiore di quel quadrato.
Procedimento:
- Preparare le diluizioni appropriate del campione da esaminare utilizzando bianchi di diluizione da 9 ml mescolando accuratamente tra le diluizioni (1 mL di sospensione in 9 mL di fisiologica)
- Se le cellule devono essere colorate prima dell’esame, operare con la colorazione come indicato sopra. Assicurarsi di registrare i volumi e gli specifici fattori di diluizione utilizzati.
- Posizionare con una pipetta Pasteur il campione diluito aree di erogazione (scanalatura a V) su ciascuna superficie di conteggio. Vortexare preventivamente per evitare le ci siano degli aggregati di cellule.
- Posizionare il vetrino coprioggetto dell’emocitometro (Burker) sulla griglia di conteggio e fissarlo tramite le 2 pinzette metalliche; l’azione capillare dovrebbe attirare il campione sotto il vetrino coprioggetto e riempire uniformemente l’area di conteggio.
- Utilizzando obiettivi 40× o 100×, contare un numero di quadrati sufficiente per ottenere un conteggio totale di circa 50 celle. I risultati tra le due griglie possono quindi essere mediati per fornire un valore medio. Per la conta bisogna considerare la madre + gemma = 1. Attenzione: evitare di sporcare il vetrino coprioggetto.
FORMULA DEL CONTEGGIO IN CAMERA DI BURKER:
(N° cellule in n1) x 104 x FD = cellule/ml nella sospensione originaria
- n1: è tutto il quadrato grande della Burker, composto da 16 quadrati piccoli, e due bordi interni a scelta, escludendo le cellule che cadono sulle righe della zigrinatura
- FD: fattore di diluizione, es diluendo circa 1:50 (FD = 50) o 1:100 (FD = 100) quindi basta moltiplicare il numero ottenuto dal conteggio per 104 e per la diluizione adottata, per avere le cellule/ml nella beuta originale. Bisogna contare almeno 100 cellule totali.
- 104: fattore di conversione volumetrica della camera Burker.
Blu di metilene
Il blu di metilene esiste in due stati redox dipendenti; ridotto e ossidato. Lo stato ridotto (leuco-forma) è incolore mentre la forma ossidata è blu. Se una cellula di lievito vitale prende il colorante, il blu di metilene viene ridotto alla forma incolore in modo che la cellula appaia incolore (o bianca) sullo sfondo blu. Pertanto, si presume che le cellule che riducono il colorante alla forma incolore siano vitali, mentre il lievito morto non riduce il colorante ed appare blu.
Sebbene siano disponibili diverse forme di blu di metilene, la preparazione utilizzata per il lavoro biologico è il blu di metilene cloruro; il blu di metilene diventa rapidamente tossico per i microrganismi, i preparati devono quindi essere esaminati al microscopio entro 10 minuti.
Preparazione:
- Preparare un tampone citrato sciogliendo 2,4 g di sodio idrogeno citrato (Na2HC6H5O7) e 2,1 g di sodio diidrogeno citrato (NaH2C6H5O7) in una quantità minima di acqua distillata e diluire a 100 ml. Se necessario, regolare il pH a 4,6.
- Sciogliere 0,3 g di blu di metilene cloruro in 30 ml di etanolo al 95% v/v.
- Aggiungere 100 ml di tampone citrato alla soluzione di blu di metilene.
Esempio conta camera di Thoma
- ci sono 70 cellule in 50 quadratini: N = 1,4 cellule/ quadratino
- ogni quadratino corrisponde ad un volume 0.00025 mm3 (1/4000)
- il numero di cellule per cm3 o ml è dato da:
D x 4000 x 1000 x N
dove D è il fattore di
diluizione e 1000 il fattore per convertire mm3 in cm3
Risultato (se D=1): 5,6×106 cellule/ml
